Метод Ван Соеста — система последовательного фракционирования углеводов корма растворами детергентов. Пробу обрабатывают нейтральным детергентом с амилазой и получают НДК (NDF), остаток обрабатывают кислотным детергентом и получают КДК (ADF), затем растворяют целлюлозу серной кислотой 72 % и получают лигнин КДЛ (ADL). В России методы закреплены в ГОСТ ISO 16472-2014 и ГОСТ ISO 13906-2013.

Почему это система, а не два отдельных анализа

Питер Ван Соест предложил в начале 1960-х годов идею, которая изменила зоотехнический анализ: делить корм не по химическим классам веществ, а по доступности для животного.

Классическая схема Вейнде делила корм на протеин, жир, сырую клетчатку и БЭВ (безазотистые экстрактивные вещества). БЭВ при этом считались «по разности» и сваливали в одну кучу крахмал, сахара и растворившуюся гемицеллюлозу — вещества с принципиально разной судьбой в рубце.

Детергентная система устроена иначе. Нейтральный детергент разделяет корм ровно по границе клеточной стенки: содержимое клетки (сахара, крахмал, белки, жиры, пектины) переходит в раствор, клеточная стенка остаётся. Дальше стенка разбирается на составляющие по убыванию доступности.

Отсюда расчётные фракции:

Гемицеллюлоза ≈ аНДК − КДК

Целлюлоза     ≈ КДК − КДЛ

Ключевое свойство метода: он операционный. НДК — не химическое вещество, а «то, что осталось после конкретной процедуры». Отсюда абсолютное требование к соблюдению режимов: отклонение от методики не даёт «менее точный НДК», оно даёт другой показатель.

Официальные методы

Оба ГОСТа — прямые переводы стандартов ISO. Это удобно: методика в вашей лаборатории и в лаборатории зарубежного контрагента совпадает буквально.

Пробоподготовка: где метод ломается чаще всего

Сушка — не выше 60 °C. Оба стандарта требуют этого прямым текстом, и это не перестраховка. При высокой температуре идёт реакция Майяра: белки связываются с углеводами, продукты реакции не растворяются детергентом и оседают в остатке. Стандарт называет это «образованием искусственной клетчатки и лигнина».

Результат: завышенные НДК, КДК и особенно КДЛ. Пересчитать или скорректировать нельзя — информация о реальном составе уничтожена. Проба, высушенная в обычном шкафу при 105 °C, для детергентного анализа непригодна.

Для влажных проб ГОСТ ISO 13906 допускает вакуумный сушильный шкаф при (60 ± 2) °C — сушка идёт быстрее при той же температуре.

Помол — 220–260 мкм. Мельница циклонного типа с ситом 2 мм или режущая мельница с ситом 1 мм. Размер частиц влияет на результат напрямую: слишком мелкий помол проходит сквозь фильтр и занижает результат, слишком грубый не полностью экстрагируется.

Возврат остатка обязателен. При размоле проба разделяется, и волокнистая фракция проходит через измельчитель последней. Материал, оставшийся в мельнице, присоединяют к размолотой пробе. Если этого не делать, теряется именно то, что мы измеряем.

Перемешивание по методике стандарта. ГОСТ ISO 16472 описывает процедуру буквально: пробу помещают на лист бумаги примерно 40 × 40 см, согнутый по обеим диагоналям, поднимают противоположные углы, расстилают, поворачивают на 90°, поднимают другие два. Повторить 11 раз. Выглядит педантично, но за этим стоит реальная проблема расслоения пробы по фракциям.

Обезжиривание. Обязательно при содержании жира от 10 %, рекомендуется от 5 %. Четырёхкратная экстракция ацетоном по 30–50 см³, замачивание не менее 3–5 минут каждый раз.

Определение аНДК: ход анализа

Реактивы. Раствор нейтрального детергента на 1000 см³: 4,0 г гидроокиси натрия, 14,6 г ЭДТА, 4,56 г двузамещённого фосфорнокислого натрия, 6,81 г десятиводного борнокислого натрия, 30 г лаурилсульфата натрия, 10 см³ триэтиленгликоля как противопенного средства. NaOH и ЭДТА допускается заменить 18,6 г динатриевой соли ЭДТА.

pH раствора — 6,95–7,05. Если отклонение превышает 0,5 единицы, раствор бракуют. Дату приготовления, измеренный pH и все корректировки регистрируют в журнале реактивов.

Стандартизация амилазы. Раствор термостабильной α-амилазы должен быть подобран так, чтобы двукратное внесение по 2 см³ полностью удаляло крахмал из 0,5 г сырого кукурузного крахмала. Процедура подбора описана в приложении В к ГОСТ ISO 16472: серию доз в геометрической прогрессии проверяют раствором йода и выбирают минимальную дозу, дающую светло-жёлтую окраску.

Критично: цвет оценивают при температуре растворов (20,0 ± 0,5) °C и строго через 90–120 секунд после добавления йода. Розово-янтарная окраска быстро блекнет, и промедление приводит к занижению дозы.

Активность основного раствора контролируют каждые 6 месяцев хранения. Рабочий раствор хранят в холодильнике не более пяти дней.

Ход анализа. Навеска — (1 ± 0,001) г; на установке типа Fibertec с тиглем Р2 — (0,5 ± 0,05) г. Вносят (0,5 ± 0,1) г сернистокислого натрия и (50 ± 5) см³ раствора НД. Реактивы добавляют не ранее чем за 60 минут до кипячения.

Нагревают до закипания за 4–5 минут, вносят 2 см³ раствора амилазы. Кипятят 60 минут — так, чтобы наблюдалось энергичное движение частиц без избыточного пенообразования. Первые 1–2 минуты проба может сильно вспениваться; снижать нагрев при этом нельзя.

Фильтрование. Тигель предварительно прогревают горячей водой 30–60 секунд — это условие успешного фильтрования, а не формальность. Декантируют верхний слой раствора, используя минимальный вакуум. Остаток не доводят до сухости: пересушенный остаток забивает фильтр.

Тигель наполовину заполняют горячей водой, добавляют 2 см³ амилазы, выдерживают 45–60 секунд. Затем два-три замачивания горячей водой по 40–50 см³ по 3–5 минут. Далее ацетон дважды по 40–50 см³.

Сушка и озоление. Сушка при (105 ± 1) °C не менее 8 часов. Озоление при (500 ± 20) °C в течение 5 часов.

Вода для промывки должна быть горячее 95 °C, скорость истечения из носика — 35–40 см³ за 10 секунд. Тонкая струя нужна, чтобы смывать частицы со стенок давлением, а не объёмом.

Определение КДК и КДЛ

Кислотный детергент: 20 г цетилтриметиламмония бромида на 1 дм³ серной кислоты молярной концентрации 0,5 моль/дм³.

Навеска — (1000 ± 2) мг. Приливают 100 см³ раствора, доводят до кипения за 5–10 минут, вносят 2–4 капли н-октанола против вспенивания. Через 5–10 минут кипения ополаскивают стенки колбы струйкой раствора (не более 5 см³). Кипятят (60 ± 5) минут от момента закипания.

Промывка водой 90–100 °C трижды по 40 см³ с разрушением уплотнённого остатка, затем ацетон 30–40 см³ до полного обесцвечивания — обычно достаточно двух циклов. Сушка не менее 5 часов при (103 ± 2) °C, предпочтительно на ночь. Озоление при (525 ± 15) °C не менее 3 часов.

Отдельно стоит выделить предупреждение стандарта: остатки кислоты при сушке концентрируются, вызывают обугливание остатка и занижают результат. Промывать нужно до полного удаления кислоты, включая стенки и дно тигля.

КДЛ. Раствор серной кислоты 72 % (относительная плотность 1,634 при 20 °C) охлаждают до 15 °C, приливают к остатку КДК, перемешивают стеклянной палочкой до однородной пасты, разбивая комочки. Палочку оставляют в тигле. Перемешивают каждый час, поддерживая 20–23 °C. Через 3 часа фильтруют, промывают горячей водой до нейтральной реакции по лакмусу, сушат и озоляют.

Пределы определения: 1 % для КДК, 1,5 % для КДЛ. Результаты ниже выражают как «КДК < 1,0 %» или «КДЛ < 1,5 %».

Две технологии: тигли и фильтр-пакеты

Классическая процедура работает с тиглями: кипячение в колбе, перенос, фильтрование под вакуумом. Альтернатива — технология фильтр-пакетов, где проба помещается в пакет из инертного полимера, а экстракция и фильтрование идут одновременно в общем сосуде.

Устранение переноса пробы — главное практическое преимущество: именно на переносе теряется остаток при классической схеме. Процедуры производителей фильтр-пакетов построены на AOAC 2002.04 для НДК и AOAC 973.18 для КДК.

Выбор пакета зависит от помола: при тонком размоле под ИК-калибровку (сито 0,5–1,0 мм) частицы проходят сквозь стандартный F57, и нужен более плотный вариант.

Обслуживание тиглей, если работаете классически

Новые тигли моют и прокаливают при 500–525 °C в течение 1 часа. После каждого использования — прокаливание 3 часа, удаление золы, замачивание в растворе детергента с ультразвуковой обработкой 7–10 минут, ополаскивание горячей водой и замачивание не менее 30 минут.

Скорость фильтрования нужно контролировать периодически. Тигель наполняют дистиллированной водой и засекают время полного истечения без вакуума:

Если промывание кислотным или щелочным раствором не восстанавливает скорость — тигель бракуют. Продолжать работать на «медленном» тигле бессмысленно: он даёт систематически завышенный результат за счёт неполной промывки.

Что делать, когда фильтрование не идёт

ГОСТ ISO 16472 содержит редкий для отечественной нормативки раздел — разбор проблемных проб по симптомам. Это самая практичная часть стандарта.

Раствор молочного цвета, непрозрачный, фильтруется медленно. Высокое содержание крахмала. Решение: дополнительные 2 см³ амилазы при втором замачивании водой, сокращение времени замачиваний, поддержание температуры выше 85 °C.

Тигель закупоривается, дополнительная амилаза не помогает. Проба содержит остатки белка, камеди или слизи — типично для мясных продуктов и муки некоторых масличных семян. Решение: обязательный предварительный прогрев тигля горячей водой и кварцевый песок как фильтровальное средство (15 г для тиглей Гуча, 6–8 г для Р2, фракция 40–200 меш). Клейкие вещества прилипают к песку и не забивают фриттовый диск.

Остаток глянцевитый, полупрозрачный, с каждым замачиванием фильтруется хуже. Пектиновые вещества. Решение: прогреть тигель, переносить остаток максимально быстро, не давая осесть; сокращать замачивания, чтобы температура не падала ниже 85 °C — иначе пектин желатинируется прямо в тигле. Фильтровальные средства в порядке предпочтения: кварцевый песок 12–15 г, затем маты из стекловаты или стекломикроволокна.

На поверхности плавают шарики жира. Анализ нужно повторить с предварительной экстракцией ацетоном или эфиром. Молочный раствор с жировыми каплями — прямое указание, что обезжиривание было недостаточным.

Проба содержит мелкие частицы, глину или каловое вещество. Увеличить время осаждения до 2 минут после снятия с нагревателя и использовать фильтровальное средство: микроволокнистые маты, керамическое волокно, кварцевый песок.

Ничего не помогает. Уменьшить навеску до 0,3 г, добавив фильтровальное средство. Важная оговорка: уменьшение навески повышает влияние ошибки взвешивания и увеличивает разброс. При содержании клетчатки менее 1,5 % навеску не уменьшают — результат записывают как «трудновыполнимый анализ, содержание клетчатки менее 1,5 %».

И отдельное правило, которое нарушают чаще всего: ацетон не добавляют, пока не удалена вся промывная вода. Это иногда улучшает фильтрование, но детергент и растворённые в нём вещества при этом не вымываются — результат завышается.

Контроль качества

Оба стандарта задают одинаковую схему: не менее одной пробы внутреннего контроля и двух холостых опытов на первые 20–30 образцов серии, далее по одному контрольному и одному холостому на каждые следующие 20–30.

Контрольный материал для аНДК. Стандарт называет пивную дробину, злаковое сено и кукурузный силос, высушенные при температуре ниже 60 °C. Предпочтителен кукурузный силос: он содержит и крахмал, и травянистые клеточные стенки, поэтому реагирует на любые нарушения реактивов и процедуры.

Контрольная карта. Приемлемое стандартное отклонение между повторными анализами контрольного материала — ±1,00 % аНДК. Результаты наносят на X-карту и проверяют на тренды:

• выход за ±2σ — предупредительная граница, возможны проблемы с системой;
• выход за ±3σ — потеря контроля, партия бракуется и анализируется заново;
• два последовательных результата по одну сторону среднего между предупредительной и контрольной границей — тоже потеря контроля, даже если формально ни один не вышел за пределы.

Последний пункт неочевиден и потому регулярно игнорируется. Два результата подряд «на грани» — это уже сигнал.

Повторности. Если анализы выполняются без повторностей, в каждую серию включают минимум один набор из двух. Повторности не должны идти подряд: одну ставят в начало серии, другую в конец. Смысл в том, чтобы поймать дрейф условий внутри серии.

Холостые тигли. Изменение массы после экстракции или прокаливания — не более 0,01 г. Превышение 10 мг или масса после озоления меньше массы пустого тигля означает недостаточную очистку тиглей либо нарушения при взвешивании.

Расширения системы

Детергентная схема — основа для нескольких более тонких показателей.

Переваримость НДК (NDFD). Навеску инкубируют в рубцовой жидкости или ферментном растворе заданное время (обычно 24, 30 или 48 часов), после чего определяют остаточный НДК. Показатель различает корма с одинаковым НДК, но разной кормовой ценностью — именно на нём построен индекс RFQ.

Неперевариваемый НДК (uNDF). Остаток после длительной инкубации, чаще 240 часов. Оценивает физический предел использования клетчатки.

Газообразование in vitro. Кинетика ферментации по объёму выделяющегося газа: показывает не только сколько переварится, но и с какой скоростью — важно для баланса рациона по скорости высвобождения энергии.

Практически удобно, что фильтр-пакеты пригодны и для детергентного анализа, и для последующей инкубации: один и тот же пакет проходит обе стадии без переноса пробы.

Оборудование

Обязательный минимум:

• лабораторная мельница циклонного или режущего типа с ситом 1–2 мм;
• аналитические весы с точностью 0,0001 г;
• сушильный шкаф с режимом 60 °C для пробоподготовки — отдельно от шкафа на 105 °C;
• муфельная печь до 550 °C с контролем стабилизации;
• установка для кипячения с обратными холодильниками или анализатор клетчатки;
• вакуумная система фильтрования с ловушкой и резервуаром;
• источник горячей воды выше 95 °C непрерывного действия;
• оборудование для экстракции жира для проб с жиром выше 5 %.

Для полной схемы НДК → КДК → КДЛ удобнее анализатор клетчатки, поддерживающий все три определения: условия остаются сопоставимыми, а последовательный анализ идёт без переноса остатка между приборами.

Для работы с переваримостью потребуются лабораторный инкубатор и, при изучении кинетики ферментации, система контроля газообразования.

Эксперт статьи, которую Вы читаете:

Чистяков Виталий

Опыт

более 10 лет

Адрес

г. Москва, ул. Космонавта Волкова 20 оф. 229

Телефоны

+7 (499) 429-0803

Бесплатная консультация